Hi-C (High-through chromosome conformation capture) 是以整個細(xì)胞核為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析方法，研究全基因組范圍內(nèi)整個染色質(zhì)DNA在空間位置上的關(guān)系，獲得高分辨率的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息以及染色質(zhì)調(diào)控元件相互作用圖譜。Hi-C可以與RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seq和WGBS（全基因組甲基化測序技術(shù)）等數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，從基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)來闡述生物體表型形成的相關(guān)機制。而其中ATAC-seq技術(shù)是繼FAIRE-seq、MNase-seq、DNase-seq目前最火熱的研究染色質(zhì)開放性的新技術(shù)，自2013年后，文章的發(fā)表量逐年攀升。百邁客已做好承接各種組織類、細(xì)胞類樣本的HiC互作和ATAC-seq的準(zhǔn)備，成功案例和項目經(jīng)驗還缺您的一把火，年底大促銷等您快快來咨詢哦！

英文名稱：Acute depletion of CTCF rewires genome-wide chromatin accessibility

雜志名稱：Genome Biol.

影響因子：13.583

發(fā)表日期：2021年8月24日

摘要

CCCTC-結(jié)合因子(CTCF)是一種高度保守的含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，被稱為“基因組編織大師”。它是研究最廣泛的三維(3D)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)在CTCF急性衰竭細(xì)胞模型和其他基因敲除模型中，CTCF在全基因組TAD和TAD內(nèi)部loop環(huán)的形成中是不可或缺的。為了更好地理解CTCF結(jié)合占用率如何促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本文系統(tǒng)地進(jìn)行了多組學(xué)研究，特別關(guān)注染色質(zhì)可及性。通過系統(tǒng)整合了ATAC-seq、RNA-seq, WGBS, Hi-C, Cut&Run和CRISPR-Cas9基因篩選技術(shù)，以及深度蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用以研究CTCF蛋白急性耗竭對細(xì)胞的影響。

材料方法

實驗材料：人B細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病（B-ALL）細(xì)胞系SEM（DSMZ），3個單細(xì)胞克隆(clones 27, clones35和clones42)分別用IAA處理24 h和48 h誘導(dǎo)CTCF退化。

ATAC-seq：有無IAA處理的三個克隆細(xì)胞樣本，一式兩份。

全基因組甲基化測序（WGBS）：IAA處理24h或無IAA處理的clone27。

蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析：CTCFAIDSEM細(xì)胞，分為4個組：no IAA，+IAA 12h，+IAA 23h和+IAA 48h，一式三份。

RNA-seq：有無IAA處理24h或48h的DSMZ。（前期研究）

Hi-C：有或者無IAA處理的clone27和clone35。（前期研究）

Cut&Run實驗：有或者無IAA處理的clone35和clone42，選用CTCF抗體進(jìn)行富集。（前期研究）

一、急性CTCF耗竭改變了染色質(zhì)的可及性

前期研究已經(jīng)通過將雙等位基因miniAID-mClover3標(biāo)簽導(dǎo)入人的內(nèi)源性CTCF位點，并產(chǎn)生了三個CTCFAID細(xì)胞的克隆。在強力霉素和生長素(IAA)處理下，強制表達(dá)與Skp1/Culin/F-box (SCF)泛素連接酶組分連接的OsTIR1，快速降解CTCF融合蛋白(圖1A)。當(dāng)強力霉素和IAA完全從培養(yǎng)基中洗脫后，這種降解是可逆的。通過對三個單細(xì)胞來源的克隆進(jìn)行IAA處理24小時的免疫印跡實驗，證實了CTCF能夠有效降解(圖1B)，類似于之前在48h處理條件下的研究結(jié)果。

為了研究CTCF耗竭對全基因組染色質(zhì)可及性的影響，對有或無IAA處理的CTCFAID細(xì)胞進(jìn)行了ATAC-seq，同時野生型SEM細(xì)胞和通過CRISPR敲除兩個不相關(guān)靶點USF1和USF2的SEM細(xì)胞作為對照。總的來說，共發(fā)現(xiàn)了8876個顯著降低的差異可及性區(qū)域(DARs)， 8042個可及性顯著增加的DARs。熱圖和峰值信號強度結(jié)果都證實了DARs具有高度重現(xiàn)性(圖1C, D)。正如預(yù)期的那樣，這些DARs在熱圖中的聚類效果顯示出與CTCF耗竭相互一致的趨勢，但在USF1/2敲除的SEM細(xì)胞中保持不變，表明這些DARs具有依賴CTCF的特征。

接下來分析這些DARs與它們最近的CTCF motif之間的物理距離。結(jié)果表明，可及性減弱的DARs更接近于最近的CTCF motifs。相比之下，可及性增強的DARs與CTCF motif的距離顯著高于可及性減弱的DARs，但顯著低于對照組(圖1E)。

圖1 急性CTCF耗竭會改變?nèi)旧|(zhì)的可及性

二、急性CTCF耗竭后染色質(zhì)可及性特征發(fā)生變化

前面綜合分析了在CTCF耗竭后，隨著染色質(zhì)可及性的改變，轉(zhuǎn)錄因子的占用情況。接下來通過查看motif數(shù)據(jù)庫TRANSFAC中所有帶注釋的TF motif，在三類區(qū)域中計算他們的富集頻率：減弱的DARs、增強的DARs和對照區(qū)域。發(fā)現(xiàn)在減弱的DARs中最富集的TFs是CTCF和黏連蛋白(SMC3和RAD21)(圖2A)。Tn5插入位點的foot-printing分析證實，它們的motifs在motif中心受到保護(hù)(圖2C)。這些結(jié)果表明，減弱的DARs反映了CTCF耗竭產(chǎn)生的影響。

增強的DARs也富集到了CTCF motif，與之前的CTCF-motif距離分析一致(圖1E)。然而，最富集的TF不是CTCF motif。相反，有許多是與活性轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一般轉(zhuǎn)錄因子(GTFs)(圖2B, D)。這些數(shù)據(jù)說明DARs的調(diào)控作用很可能和CTCF的抑制功能相關(guān)。

雖然CTCF和黏連蛋白的motifs在增強和減弱的DARs中都富集到了，但它們在增強的DARs中的foot-printing分析表現(xiàn)出不同的模式特征。與減弱的DARs中Tn5保護(hù)的motif中心相比，這些motif周圍的近端側(cè)翼區(qū)域更受保護(hù)，這與活性啟動子和增強子相關(guān)的串聯(lián)CTCF motif(2xCTSes)一致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8042個區(qū)域中有1244個(15.4%)的DARs與2xCTSes重疊，比對照區(qū)域和減弱DARs區(qū)域更富集。而這些2xCTSes被認(rèn)為調(diào)節(jié)染色質(zhì)loop環(huán)，觀察到的DARs可能與染色質(zhì)loop環(huán)直接相關(guān)。

接下來，將這些loop環(huán)分成三組，并用不同的標(biāo)準(zhǔn)繪制它們的正常染色質(zhì)接觸數(shù)。與增強的DARs重疊的loop環(huán)展現(xiàn)出更多的染色質(zhì)內(nèi)接觸，而與減弱的DARs重疊的loop環(huán)展現(xiàn)出更少的染色質(zhì)內(nèi)接觸。三組的染色質(zhì)內(nèi)接觸均在CTCF耗竭后減少。然而，重疊于減弱的DARs的loop環(huán)減少的觸點顯著多于重疊于對照NFRs區(qū)域和增強的DARs的loop環(huán)(圖2E)。總的來說，loop環(huán)的形成可能只反映CTCF的結(jié)合狀態(tài)，而不是直接調(diào)控染色質(zhì)可及性。然而，較弱的遠(yuǎn)端環(huán)似乎更容易失去CTCF。

最后嘗試探索這些DARs是否與TAD邊界有關(guān)，發(fā)現(xiàn)對照的ATAC-seq峰和減弱的DARs到TAD邊界的距離分布相似，而增強的DARs總體上出現(xiàn)在遠(yuǎn)離TAD邊界的地方(圖2F)。已知TAD邊界在CTCF結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄活性基因(包括管家基因)中富集。CTCF占據(jù)的物理位置似乎與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。

圖2 急性CTCF耗竭后染色質(zhì)可及性的特征變化

本文假設(shè)急性CTCF耗盡的細(xì)胞模型最適合于確定全基因組DNA甲基化的即時反應(yīng)。

令人驚訝的是，當(dāng)用WGBS生成DNA甲基化譜時，并沒有觀察到急性CTCF耗盡后全基因組DNA甲基化的變化。與ATAC-seq和CTCF Cut&Run的分析結(jié)果不同，DARs周圍的DNA甲基化水平在對照組和CTCF耗竭組之間沒有發(fā)現(xiàn)有差異性(圖S9A)。接下來分析差異甲基化區(qū)域(DMRs)，發(fā)現(xiàn)只有49個顯著差異區(qū)域(圖S9B)。進(jìn)一步檢查這些增強的DMRs富集的motif，并沒有發(fā)現(xiàn)CTCF或黏連蛋白(圖S9C)，表明這些DMRs與CTCF占用沒有直接關(guān)聯(lián)。總之，研究結(jié)果表明，急性CTCF耗竭不會影響SEM細(xì)胞中全基因組DNA甲基化。

圖S9 急性CTCF耗竭不影響全基因組DNA甲基化

三、依賴CTCF的染色質(zhì)可及性通過啟動子或增強子-啟動子loop環(huán)調(diào)節(jié)基因表達(dá)

雖然CTCF在某些位點的基因調(diào)控中不可或缺，如H19-IGF2、β-血紅蛋白、原鈣粘蛋白簇和TP53等，但目前尚不清楚這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否由CTCF直接作用，或者染色質(zhì)可及性是否也發(fā)揮了作用?；鹕綀D顯示增強的DARs中基因啟動子數(shù)比減弱的DARs中的更多(圖3A)。接下來計算DARs中的基因數(shù)，發(fā)現(xiàn)這些基因在IAA處理后的細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)中也表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄差異。更多減弱的DARs往往與下調(diào)的基因相關(guān)，而更多的增強的DARs通常與基因表達(dá)增多相關(guān)。

對于表現(xiàn)出一致變化的基因，進(jìn)一步檢查它們啟動子的ATAC-seq信號，并確認(rèn)模式與預(yù)期一致(圖3B)。還使用基因表達(dá)水平和ATAC-seq信號z-score制作了熱圖，確認(rèn)了可重復(fù)的模式(圖3C)?；谂琶罡叩幕蚣M(jìn)行了基因集富集分析(GSEA)，結(jié)果表明減弱的DARs與基因下調(diào)相關(guān)，而增強的DARs與基因上調(diào)相關(guān)。因此得出結(jié)論，與DARs相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化特征直接響應(yīng)CTCF的急性耗竭。
CTCF基因啟動子的染色質(zhì)可及性在CTCF耗竭時也有所增加(圖3D)，這一點通過定量PCR (Q-PCR)進(jìn)一步得到驗證(圖3E)。這些數(shù)據(jù)表明CTCF可以抑制自身以保持最*表達(dá)水平。對于CTCF耗竭后被下調(diào)的基因，如MYC，并沒有在啟動子區(qū)域檢測到有統(tǒng)計學(xué)意義的染色質(zhì)可及性變化。因此，當(dāng)啟動子區(qū)域保持開放時，遠(yuǎn)端增強子區(qū)域的染色質(zhì)景觀變得更難以接近，再加上CTCF耗竭，可能在控制能調(diào)控MYC轉(zhuǎn)錄的遠(yuǎn)端增強子-啟動子loop環(huán)的形成中發(fā)揮作用。

圖3?啟動子或增強子-啟動子環(huán)調(diào)節(jié)基因表達(dá)

四、綜合分析假定的絕緣子CTCF結(jié)合位點

本文通過綜合分析建立了一個框架來識別假定的CTCF介導(dǎo)的絕緣子元件。將ATAC-seq結(jié)果中的3490個峰和有CTCF結(jié)合的峰取交集，共有716個增強的ATAC-seq峰。接下來，將它們與RNA-seq結(jié)果中上調(diào)的基因進(jìn)行比對，判斷TSSs是否位于距離DARs區(qū)域2-50 kb的范圍。綜上所述，有67個基因符合這些標(biāo)準(zhǔn)(圖(Fig 4A)。這67個基因中有20個基因的附近有染色質(zhì)loop環(huán)。例如，在BLCAP基因上游約7 kb處觀察到一個假定的抑制性CTCF結(jié)合峰，該峰位于Hi-C數(shù)據(jù)所示的染色質(zhì)絕緣loop環(huán)中(圖4B )。在未經(jīng)過IAA處理的對照CTCFAID細(xì)胞中，CTCF與該motif結(jié)合導(dǎo)致染色質(zhì)可及性受到抑制，這在ATAC-seq數(shù)據(jù)中信號的缺失很明顯。然而，在急性CTCF耗竭時，ATAC-seq峰值信號和BLCAP mRNA表達(dá)明顯增加(圖4C)。

圖 4 綜合分析假定的絕緣子CTCF結(jié)合位點

五、CTCF抑制BLCAP表達(dá)的功能驗證

為了進(jìn)一步驗證預(yù)測的假定絕緣子的作用，將慢病毒表達(dá)的引導(dǎo)RNA感染表達(dá)Cas9的SEM細(xì)胞中，然后進(jìn)行抗生素選擇。Sanger基因組測序(Inference of CRISPR edit, ICE)在目標(biāo)人群中檢測到約61%的總indel頻率(圖5A)，與非靶向?qū)驅(qū)φ战M(sgNT)相比，導(dǎo)致BLCAP mRNA表達(dá)顯著增加(圖5B)。用IAA處理CTCFAID細(xì)胞24和48小時，然后洗脫IAA進(jìn)行CTCF修復(fù)。通過RNA-seq分析和Q-PCR驗證，驗證急性CTCF蛋白耗竭時BLCAP mRNA的表達(dá)(圖5C)。不出所料，生長素處理24或48 h后CTCF蛋白急性耗竭，BLCAP表達(dá)水平顯著升高。更重要的是，洗脫生長素后，其表達(dá)水平恢復(fù)到親本細(xì)胞的水平(圖5D)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)有力地支持了CTCF在BLCAP調(diào)控區(qū)域的占用充當(dāng)了控制BLCAP表達(dá)的功能絕緣體。

圖 5 CTCF在抑制BLCAP表達(dá)方面的作用的功能驗證

六、多組學(xué)聯(lián)合揭示CTCF共同調(diào)控因子

為了進(jìn)一步研究急性CTCF耗竭對基因表達(dá)的影響，本文系統(tǒng)探索了CTCF介導(dǎo)的下游蛋白組和磷酸化蛋白組水平的基因表達(dá)，并將其與ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析(圖6A)?？偟膩碚f,將24小時治療組與無IAA治療組比較，確定了2550個差異表達(dá)蛋白質(zhì)和1895個差異表達(dá)磷酸肽(圖6B）。雖然觀察到整體蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組之間存在合理的相關(guān)性(圖6C)，但只有488個DE mRNA。與免疫印跡和Q-PCR結(jié)果一致，基于質(zhì)譜(MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA-seq分析證實，急性CTCF耗竭后，在蛋白水平上CTCF表達(dá)顯著減少，在mRNA水平上表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)表明，盡管mRNA水平的變化并不明顯，急性CTCF耗竭誘導(dǎo)了下游響應(yīng)的大量中斷。

本文開發(fā)了一種多組學(xué)聯(lián)合的方法來定義CTCF共調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，總共鑒定了40個CTCF共同調(diào)控因子，這些TF在急性CTCF耗竭時在mRNA和/或蛋白質(zhì)水平上顯著影響其下游靶基因的表達(dá)(圖6D)。正如預(yù)期的那樣，這40個CTCF共調(diào)控因子中的大多數(shù)也在CTCF介導(dǎo)的DARs中有共同定位，證實了它們與CTCF有著潛在的直接共同調(diào)控作用。

此外，我們還研究了CTCF的共調(diào)控模式，并選擇了候選的TF包括 ZBTB7A和YY1，同時DUX作為陰性對照來觀測。與對照和增強的DARs相比，這兩個motif的絕大多數(shù)距離減弱的DARs更近，這表明CTCF的耗竭可能會影響相鄰的開放染色質(zhì)可及性，導(dǎo)致與其他TFs結(jié)合的缺失(圖6E,F)。而DUX4和CTCF motif距離分布均勻(圖6G)。總之,本文系統(tǒng)地揭示并驗證了CTCF介導(dǎo)和招募的主要共調(diào)控因子，通過編織和改變?nèi)旧|(zhì)可及性來實現(xiàn)下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并證明了多組學(xué)分析方法是強大的，可以識別不具有明顯表達(dá)變化的隱藏主調(diào)控因子。

圖6 多組學(xué)分析CTCF調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的主共調(diào)控因子

討論

使用急性CTCF退化系統(tǒng)和豐富的可用數(shù)據(jù)集提供了直接證據(jù)，表明CTCF調(diào)控染色質(zhì)可及性，但不調(diào)控DNA甲基化。CTCF可能在串聯(lián)CTCF結(jié)合位點維持染色質(zhì)可及性，從而招募CTCFL到附近的基因并啟動轉(zhuǎn)錄。雖然CTCF的急性耗竭會深刻地干擾整個染色質(zhì)相互作用和可及性，但轉(zhuǎn)錄水平通常不會有顯著改變。這些發(fā)現(xiàn)表明在CTCF急性耗竭后蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾過程中發(fā)生了潛在的全局變化?？傊珻TCF的急性耗竭改變了染色質(zhì)相互作用和可及性，需要進(jìn)一步的研究來更好地理解CTCF的耗竭如何導(dǎo)致蛋白質(zhì)和翻譯后修飾的巨大變化。

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