研究背景

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型，包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。腺癌是最常見的非小細(xì)胞肺癌類型，目前約占所有肺癌病例的40%。近年來發(fā)現(xiàn)了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的基因改變，KRAS、EGFR和ALK是腫瘤基因組驅(qū)動因子的最常見癌基因。此外，在約50%的人類癌癥中，P53腫瘤抑制基因發(fā)生突變或缺失。野生型(WT)P53通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期、凋亡、干細(xì)胞分化、衰老、DNA修復(fù)和代謝的基因的表達(dá)，幫助維持基因組的完整性和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
長鏈非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，lncRNAs)是一種長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄RNA分子，在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中不能翻譯成蛋白質(zhì)。研究表明，lncRNAs在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化調(diào)控等生命活動中發(fā)揮重要作用，并在多種腫瘤中異常表達(dá)。lncRNAs的異常表達(dá)可作為腫瘤的促進(jìn)劑或抑制劑。研究表明，lncRNAs通過改變多條信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，目前已鑒定出一些與肺癌相關(guān)的lncRNAs，如H19、MALAT、MIR31HG、HOTAIR、DGCR5、 AFAP1-AS、SNHG1和RMRP。然而，對其他肺癌相關(guān)lncRNAs的鑒定仍有待研究。

研究方法

樣本選擇：LSL-Kras-G12D C57小鼠、Kras-G12D小鼠和P53敲除小鼠。（用表達(dá)Cre重組酶的慢病毒顆粒鼻腔滴注8周齡小鼠進(jìn)而誘發(fā)肺腺癌。腫瘤開始6周后，收集肺腺癌樣本和相應(yīng)的正常肺樣本。病毒感染后第6天，獲得NONMMUT015812-基因敲除的KP細(xì)胞(shRNA-2)和陰性對細(xì)胞(sh-Scr)。

測序技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組測序和微陣列芯片。

研究結(jié)果

1.KRAS-G12D突變和p53基因敲除小鼠肺腺癌中LncRNA的表達(dá)

使用芯片技術(shù)檢測lncRNA，差異表達(dá)lncRNAs的散點(diǎn)圖和聚類圖顯示了肺腺癌和正常肺樣本之間有明顯區(qū)別（圖A、B）。重點(diǎn)研究了在人和鼠之間具有較高差異倍數(shù)且保守的lncRNAs，當(dāng)FC＞8，P＜0.05時(shí)，鑒定到729個(gè)lncRNA。根據(jù)染色體位置保守性和序列保守性，篩選出210個(gè)具有潛在人類同源物的lncRNA用于后續(xù)驗(yàn)證，其中129個(gè)上調(diào)，81個(gè)下調(diào)(圖C、D)。根據(jù)其基因組位置，將210個(gè)lncRNA分為u(基因間)、i(內(nèi)含子)、x(反義)和o(正義重疊)四大類。已鑒定的lncRNAs大部分屬于i類，有101個(gè)(48.09%)(圖E)。

2.與p53、Kras及缺氧相關(guān)的lncRNAs分析

p53是臨床肺癌中最常見的突變抑癌基因，在我們的肺腺癌小鼠模型和KP細(xì)胞中均被誘導(dǎo)完全敲除。因此，作者探索了所選擇的210個(gè)保守的lncRNAs的非調(diào)控表達(dá)是否與p53的缺失有關(guān)。攜帶p53基因的慢病毒顆?？稍贙P細(xì)胞中重新表達(dá)p53。如下圖A所示，p53在穩(wěn)定感染的KP細(xì)胞中有效地重新表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，p53再表達(dá)顯著改變了11個(gè)lncRNAs的表達(dá)（FC≥1.5），且差異倍數(shù)與上述p53缺失的肺腺癌組織芯片數(shù)據(jù)相反(圖B)，表明p53的再表達(dá)對LncRNAs的表達(dá)有顯著影響。

Kras在肺腺癌小鼠模型和KP細(xì)胞中被激活，為了確定與Kras基因相關(guān)的lncRNAs的表達(dá)量，利用Crispr/Cas9敲除其在KP細(xì)胞中的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，Kras基因缺失改變了33個(gè)lncRNAs的表達(dá)（FC≥1.5），且差異倍數(shù)與Kras被激活的肺腺癌組織芯片數(shù)據(jù)相反(圖B)。

缺氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)顯著特征，低氧腫瘤通常對傳統(tǒng)的癌癥治療有抵抗力，且腫瘤低氧與晚期惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。作者進(jìn)一步研究了低氧調(diào)節(jié)的潛在的lncRNAs。將KP細(xì)胞在常氧(20% O2)和缺氧(1% O2)中培養(yǎng)48h，WB結(jié)果顯示缺氧可有效上調(diào)KP細(xì)胞HIF1α的表達(dá)(圖A)。RT-PCR結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的KP細(xì)胞中有13個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)，4個(gè)lncRNAs在缺氧誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)變化方向與小鼠肺腺癌組織芯片中的表達(dá)變化方向一致(圖B)。

芯片篩選出的210個(gè)LncRNAs中，有52個(gè)LncRNAs的表達(dá)變化與p53、Kras或缺氧有關(guān)。其中，2個(gè)受p53調(diào)控的lncRNAs也受Kras調(diào)控，2個(gè)受KRAS調(diào)控的lncRNAs和1個(gè)受p53調(diào)控的lncRNA在缺氧條件下也可以被調(diào)控(圖A)。選擇19個(gè)FC＞3.5的lncRNAs，采用定量RT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證其在6例肺腺癌組織和6例正常肺組織中的表達(dá)。定量RT-PCR結(jié)果顯示，19個(gè)lncRNAs的表達(dá)與微陣列結(jié)果一致(圖B)。構(gòu)建與上述19個(gè)lncRNAs相關(guān)的lncRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(LLCN)。網(wǎng)絡(luò)圖顯示，在19個(gè)lncRNAs中，有6個(gè)lncRNAs與其他lncRNAs無顯著共表達(dá)，有13個(gè)lncRNAs與其他lncRNAs顯著共表達(dá)（圖C）。

3.NONMMUT015812基因敲除對KP細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用

在已鑒定的lncRNAs中，NONMMUT015812非常有趣。(a)其在小鼠肺腺癌組織中的表達(dá)增加約150-187倍。(b)其表達(dá)與p53呈負(fù)相關(guān)。(c) NONMMUT015812基因位于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣蛋白1基因和甲狀腺素5-脫碘酶基因之間的染色體上，其中包含幾個(gè)在人和小鼠中表達(dá)差異的lncRNAs。

通過設(shè)計(jì)慢病毒介導(dǎo)的shRNAs來下調(diào)NONMMUT015812的表達(dá)，qPCR結(jié)果顯示其可使KP細(xì)胞中NONMMUT015812的表達(dá)減少80%以上(圖A)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，NONMMUT015812基因的敲除顯著抑制了KP細(xì)胞的生長(圖B)。此外，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定的NONMMUT015812基因敲除的KP細(xì)胞與對照細(xì)胞相比遷移明顯減少(圖C)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，NONMMUT015812基因敲除導(dǎo)致KP細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期，G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少(圖D)。而NONMMUT015812基因敲除對細(xì)胞凋亡無明顯影響。

RNA-seq檢測NONMMUT015812基因敲除細(xì)胞基因表達(dá)的變化。與陰性對照相比，共鑒定出1281個(gè)差異表達(dá)基因。在這些基因中，610個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，671個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖E)。KEGG通路分析表明，NONMMUT015812的下調(diào)影響了幾個(gè)與細(xì)胞生長相關(guān)的通路，包括細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和PI3K/Akt信號通路(圖F)。有趣的是，KEGG通路的富集還包括p53信號通路和幾條DNA修復(fù)通路，這意味著NONMMUT015812可能是p53通路的重要下游調(diào)節(jié)因子。與流式細(xì)胞儀分析結(jié)果一致，未發(fā)現(xiàn)凋亡信號通路。GO分析還表明，許多差異表達(dá)基因主要集中在細(xì)胞分裂、有絲分裂細(xì)胞周期和DNA復(fù)制過程中。

小結(jié)

本文研究了p53基因敲除和Kras-G12D突變的小鼠肺腺癌中l(wèi)ncRNAs的異常表達(dá)。結(jié)果顯示，210個(gè)lncRNAs（FC≥8）中，原代KP細(xì)胞中分別有11個(gè)受p53調(diào)控，33個(gè)受KRAS調(diào)控，13個(gè)受缺氧調(diào)控。在小鼠肺腺癌中顯著上調(diào)、受p53再表達(dá)負(fù)調(diào)控的NONMMUT015812，分析其細(xì)胞功能，結(jié)果表明，shRNAs敲除NONMMUT015812可降低KP細(xì)胞的增殖和遷移能力。在小鼠肺腺癌中異常表達(dá)的lncRNAs中，NONMMUT015812是一個(gè)潛在的促腫瘤基因。然而，已鑒定的lncRNAs在腫瘤發(fā)生中的功能和分子機(jī)制及其在人肺癌組織中的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

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