01 黃瓜果把長度的遺傳特征

授粉30天后，雙親Jin5-508和YN黃瓜果把長度不再增長，于是選擇該時間節(jié)點作為果把長度鑒定的時期（圖1a）。Jin5-508果把長度顯著長于YN，這種差異是因為Jin5-508果把果肉細胞體積大于YN，而非細胞數(shù)增多（圖1b,c,d,e）。統(tǒng)計F₁群體、回交群體和F₂群體果把長度發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁群體表現(xiàn)出中親表型，而回交群體表型更偏向于輪回親本，F(xiàn)₂群體表現(xiàn)出連續(xù)的近正態(tài)分布（圖1f），以上結(jié)果表明黃瓜果把長度是數(shù)量性狀。

圖1?黃瓜果把長度遺傳特征

02果把長度QTL的初定位—BSA方法+遺傳圖譜

作者在1231個F₂群體（Jin5-508 × YN）選擇了長把和短把單株各50個，構(gòu)建2個極端性狀DNA混池，對該混池及雙親進行高通量測序及BSA分析。親本測序深度分別為34x（Jin5-508）和20x（YN），混池測序深度分別為61x和52x。測序數(shù)據(jù)與黃瓜參考基因組9930比對，2個混池分別開發(fā)了342,496和399,764個SNP，基于SNP index算法，在chr7上定位到一個主效QTLFnl7.1?(閾值0.833)，區(qū)間范圍9.98–14.61 Mb（圖2c）。

圖2?BSA定位結(jié)果

為驗證BSA的定位結(jié)果，作者在3個不同環(huán)境下調(diào)查了102個F_2:3家系（Jin5-508 ×?YN）的表型，結(jié)果顯示F_2:3表型也符合正態(tài)分布（圖3a）。基于雙親重測序數(shù)據(jù)，作者在7號染色體上開發(fā)了72個雙親多態(tài)標記（SNP和InDel），用這些標記合F₂群體構(gòu)建7號染色體的連鎖圖譜。結(jié)合F_2:3群體3個環(huán)境的表型以及F₂遺傳圖譜，共同定位到了1個主效QTL（圖3b），表型貢獻率在27.9%-32.7%。綜合BSA定位和遺傳圖譜定位結(jié)果，最終吧QTL Fnl7.1定位在7號染色體上2.85Mb的區(qū)間內(nèi)。

圖3?F2:3群體表型變異及遺傳圖譜定位結(jié)果

03 Fnl7.1的精細定位

作者利用初定位側(cè)翼標記InDel01和SNP01對大規(guī)模F₂單株（4000株）進行分型，篩選得到51個區(qū)間重組單株。在InDel01和SNP01區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了另外4個標記，對51個重組單株進行分型，共得到10種不同的單體型，基于個體表型及單體型數(shù)據(jù)，Fnl7.1被縮小到25.4kb的區(qū)間（標記InDel05和SNP01）（圖4c）。為了進一步縮小區(qū)間范圍（老師態(tài)度很嚴謹，佩服），作者又構(gòu)建了一個更大規(guī)模的F₂分離群體（7600個單株），利用InDel05和SNP01進行分型后又得到4個F₂重組單株。F2重組單株自交得到4個F_2:3群體，在InDel05–SNP01區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了4個多態(tài)SNP標記，用這些標記對F_2:3群體進行篩選，發(fā)現(xiàn)有2個F_2:3群體在標記區(qū)間內(nèi)發(fā)生了重組。利用重組單株的表型及單倍型分型結(jié)果，將Fnl7.1定位在14.1kb的區(qū)間（圖4d），而在該區(qū)間內(nèi)共有2個基因，分別為CsGy7G014720和CsGy7G014730（圖4e）。

圖4?Fnl7.1精細定位過程

04 Fnl7.1功能驗證

克隆雙親14.1kb定位區(qū)間，測序后進行序列比對發(fā)現(xiàn)共有17個SNP和InDel差異，部分變異位于基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)，而位于外顯子區(qū)的則為非同義突變，另外在CsGy7G014720啟動子區(qū)有多個變異。同時，作者發(fā)現(xiàn)InDel05（位于CsGy7G014720啟動子區(qū)）與Fnl7.1共分離。以上結(jié)果表明，CsGy7G014720（后續(xù)稱作CsFnl7.1）是最有可能的候選基因。

圖5?CsFnl7.1表達分析

05 CsFnl7.1啟動子多態(tài)性影響其表達

序列分析顯示，雙親CsFnl7.1啟動子區(qū)存在多處序列差異（25個SNPs和7個InDels），因此作者將雙親的啟動子進行了克隆，分別與GUS基因構(gòu)建整合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化煙草葉片進行啟動子活性分析。發(fā)現(xiàn)Jin5-508啟動子（pCsLEA^J）活性是YN啟動子（pCsLEA^Y）活性的4倍（圖6）。這與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致（授粉當天CsFnl7.1在Jin5-508表達量顯著高于YN），從而說明CsFnl7.1表達受順式調(diào)控。

圖6?雙親CsFnl7.1啟動子活性比較

06? CsFnl7.1轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)

為進一步驗證基因功能，作者將CsFnl7.1轉(zhuǎn)入短把品種“D8”中，得到3個T2代單株（OE4、OE7和OE8）。Southern雜交顯示OE4、OE7和OE8分別插入1、1和2個拷貝（圖7a）。與對照相比，3個轉(zhuǎn)基因個體CsFnl7.1表達量顯著提高，同時果把長度也更長，說明CsFnl7.1確實能夠影響果把長度（圖7b,c,d）。分析果把果肉細胞的個數(shù)和大小發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因個體比對照個體細胞更大，但細胞數(shù)在兩者之間沒有顯著差異（圖7e,f,g），從而說明CsFnl7.1是通過調(diào)控細胞伸展來影響果把長度。

圖7?CsFnl7.1轉(zhuǎn)基因個體表現(xiàn)

07? CsFnl7.1與細胞伸展相關(guān)蛋白存在互做

利用酵母雙雜技術(shù)，以CsFnl7.1蛋白為誘餌篩選與其互做的蛋白，結(jié)果顯示共得到53個陽性克隆，在這些蛋白中有多個與細胞伸展相關(guān)，包括CsDRP6和CsGLP1（圖8a）。體外pull down實驗顯示，融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕獲，而對照GST則不能（圖8b）。以上結(jié)果充分說明CsFnl7.1與CsDRP6、CsGLP1之間存在互做關(guān)系。

圖8?酵母雙雜及pull?down分析

08? Fnl7.1的地理分布及進化分析

利用Fnl7.1啟動區(qū)的變異信息，對158個品種進行進化分析，結(jié)果顯示所有品種可被分為4個group，其中g(shù)roup1和group2主要包含來自于歐亞大陸的端果把品種，而group3主要為來自于東亞的短果把品種，來自印度多個品種在3個不同group都有分布，以上結(jié)果也可以證實Fnl7.1起源于印度的假說。

總結(jié)

本文是一篇典型的基因克隆+驗證的優(yōu)秀文章，從事農(nóng)作物、蔬菜功能基因研究的老師可以引用參考。該研究亮點是使用大規(guī)模F2分離群體，通過BSA分析+重組個體分析，就實現(xiàn)了基因的精細定位，從而避免了構(gòu)建高代回交群體的繁瑣過程，極大地縮短了基因克隆的周期，減少了多年雜交、標記篩選等工作流程。當然，能夠采用這種策略，也與物種繁殖周期、產(chǎn)籽量、QTL貢獻率等多個因素相關(guān)（我們會在下期著重討論這些問題），本研究的物種和性狀特征符合上述要求，所以能夠快速拿到基因。在這篇文章之前，2018年陳學好老師在The Plant Journal（IF=6.14）上發(fā)表了一篇黃瓜耐水淹基因克隆驗證的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1?encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”，文章思路和方法與本文基本相似，也是采用大規(guī)模F2分離群體+BSA分析的方式，感興趣的老師可以參考學習。我們不難看出，只要方法選的對，再加上細致的研究工作，就可以持續(xù)發(fā)表高分文章！

提前劇透

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