明星基因SHR、SCR又發(fā)《Cell》子刊了？這到底是怎么一回事呢？今天的文獻分享就告訴您~

研究背景

多細胞生物通過控制的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡明確細胞特性，關(guān)聯(lián)位置信息，協(xié)調(diào)器官的發(fā)育和成熟。明確這些網(wǎng)絡如何協(xié)調(diào)器官的發(fā)育和功能，需要詳細地理解該組織器官的時空基因表達模式。擬南芥的根是一個易于操作的模式器官，具有大多數(shù)細胞類型的標記，以及形態(tài)學定義的發(fā)育階段。有利于進行器官發(fā)育過程中的基因時空表達模式的研究。盡管，此前已有一些研究單位報道擬南芥單細胞測序圖譜，但是這些一代圖譜中沒有一個使用超過12,500個細胞。而且僅有一個研究單位推斷了三種以上細胞類型的發(fā)育進程。因此，目前還沒有一個全面的擬南芥根系圖譜，可以捕捉到所有主要細胞類型的發(fā)育狀態(tài)的細微變化。

研究材料

材料：擬南芥野生型(?Col-0?)?96,000個根細胞(13個樣本)，scr突變體10,000個根細胞(n=2)，shr突變體10,000個根細胞(n=2)。

方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、碘化丙啶（PI）染色

主要結(jié)果

1.?構(gòu)建擬南芥根的scRNA-seq圖譜，注釋細胞類型和發(fā)育階段

為了繪制一個全面的、器官尺度的擬南芥單細胞分辨率圖譜。作者選取5-7日齡的野生型幼苗主根尖0.5?cm的組織進行取樣，制備原生質(zhì)體，使用10X?Genomics?scRNA-seq平臺對超過96,000個根細胞進行了分析。之后結(jié)合已發(fā)表的scRNA-seq相關(guān)數(shù)據(jù)（3個樣本14,427個細胞），最終構(gòu)建了單細胞水平上的十萬級根細胞時空表達圖譜。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，每個細胞平均檢測出2,768個基因，總計24,997個基因，占擬南芥基因組中編碼基因的90%。作者推斷出jing q 的細胞類型注釋，將每個細胞分配到14個細胞類型和7個發(fā)育階段。之后，作者結(jié)合novoSpaRc、SEMITONES、ICI（index?of?cell?identity）等方法，通過每個細胞的表達譜來確定細胞類型和發(fā)育階段之間的邊界（圖1、圖2）。

2.?通過各個組織類型來推斷發(fā)育進程

為了更詳細地分析根的各個細胞的發(fā)育進程，作者從注釋的細胞系內(nèi)的簡單擬時序分析開始，基于干細胞的起源將圖譜細分成4個組織/細胞系群。并使用兩種不同方法的非圖形工具CytoTRACE和scVelo來量化細胞的分化進程。通過將擬時間順序劃分為10組（T0-T9）進行差異表達分析，確定了基因的動態(tài)表達隨著皮層和內(nèi)皮層的分化循序漸進（圖3）。同樣，在中柱細胞、表皮、側(cè)根冠細胞（LRC）和中軸細胞之間，基因也呈現(xiàn)出重疊漸進的表達模式。

3.理想傳輸理論確定發(fā)育軌跡

由于擬時序推理表明根細胞類型以不同的速率成熟，于是作者利用基于理想傳輸理論OT（Optimal?Transport）的StationaryOT分析方法來推斷整個圖譜的發(fā)育軌跡。研究人員發(fā)現(xiàn)它可以在很大程度上獨立于圖譜注釋和細胞系分割，來推斷細胞系的發(fā)育軌跡，反映每種細胞和組織類型分化的現(xiàn)有生物學知識。分化事件可以通過將多個命運概率以“三角圖”的形式投影到重心坐標中來實現(xiàn)可視化。作者利用“三角圖”分別展現(xiàn)了分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)的內(nèi)皮層和皮層細胞的命運概率（圖4D-F）。已知內(nèi)皮層標記基因SCARECROW?(SCR)?和MYB36的表達模式與伴隨細胞成熟而不斷增加的內(nèi)皮層命運概率相一致（圖4G）。之后按照發(fā)育區(qū)對生毛細胞、非生毛細胞（圖4J-L），中柱鞘、原形成層（圖4O-Q）也繪制“三角圖”。此外，理想傳輸理論也有助于識別發(fā)育調(diào)節(jié)因子。

4.scRNA-seq揭示scr突變體的分化途徑

在根的發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子SHORTROOT?(SHR)?和SCR對干細胞龕維持和組織模式形成至關(guān)重要。那么，SHR或SCR的功能喪失會如何影響組織構(gòu)成以及根細胞的特性和分化呢？由于shr和scr突變體都缺乏形成基本組織的不對稱細胞分裂，導致形成了一個單一的突變體組織層，而不是皮層和內(nèi)皮層細胞層。與先前組織特異性標記與形態(tài)檢測的突變體表型一致，通過對shr和scr突變體細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，它們中表達內(nèi)皮層marker基因的細胞顯著減少。兩個突變體原生木質(zhì)部細胞的豐度也明顯下降了，并且shr中原生韌皮部和初生韌皮部細胞豐度下降，這與shr和scr中柱缺陷的表型一致。此外，該研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)部和韌皮部中柱鞘細胞（pericycle?cell）對應的基因表達也下調(diào)了；這一結(jié)果與shr突變體影響側(cè)根發(fā)育一致（圖5）。

5.scRNA-seq表明scr突變層的轉(zhuǎn)分化

接下來，一個值得思考的問題是單一細胞是如何對報告的scr突變體層的混合特性做出貢獻的？從單一細胞的發(fā)育軌跡來說，造成這種混合特性的可能性有多種。1）細胞在發(fā)育早期獲得了內(nèi)皮層和皮層的身份，而突變層是將兩種細胞類型的異質(zhì)性混合；2）每個細胞可能具有皮層和內(nèi)皮層的混合屬性；3）細胞在發(fā)育早期只獲得一種特性，隨后改變其命運。通過StationaryOT分析來計算scr細胞的命運概率最終發(fā)現(xiàn)scr突變層細胞同時具有皮層和內(nèi)皮層的特性。有意思的是，scr突變層細胞在發(fā)育早期（分生區(qū)）主要是類似皮層，而成熟區(qū)的細胞呈現(xiàn)出內(nèi)皮層的特性（圖6-1）。

為了在體內(nèi)進一步對scRNA-seq得到的結(jié)論進行驗證，作者驗證了皮層和內(nèi)皮層標志物的空間表達模式在scr突變層是否會發(fā)生改變。在WT中，內(nèi)皮層標志基因MYB36和皮層轉(zhuǎn)錄報告基因AT1G09750?(CORTEX)在它們各自類型的伸長區(qū)表達，MYB36在分生區(qū)的內(nèi)皮層也表達。但scr突變體中，MYB36轉(zhuǎn)錄報告基因的表達僅在晚期延伸區(qū)和成熟區(qū)可見，皮層轉(zhuǎn)錄報告基因在延伸區(qū)和成熟區(qū)都有所減少（圖6-2）。以上結(jié)果都與scRNA-seq分析結(jié)果一致。

總結(jié)

這篇文章通過對不同發(fā)育階段的擬南芥根細胞進行scRNA-seq，構(gòu)建了十萬級水平的根細胞基因時空表達圖譜，并利用理想傳輸理論（OT）推斷出了細胞系的發(fā)育軌跡。同時，通過比較scr和shr突變體的scRNA-seq數(shù)據(jù)，從單細胞水平闡釋了scr突變層細胞同時具有皮層和內(nèi)皮層混合特性，并指出了其發(fā)育軌跡上的特性轉(zhuǎn)變。最后，使用內(nèi)皮層和皮層轉(zhuǎn)錄報告基因?qū)σ陨辖Y(jié)論進行了體內(nèi)驗證。

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